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技術(shù)文章
海南大學(xué)林桓副研究員團隊以模式藍藻（細長(cháng)聚球藻 PCC 7942）為研究對象，與島津廣州分析中心展開(kāi)深入合作，通過(guò)微流液相色譜儀（島津Nexera Mikros）結合三重四級桿質(zhì)譜儀（島津LCMS-8050）建立了一套兼具靈敏度與特異性的修飾核苷鑒定方法，并對細長(cháng)聚球藻PCC 7942 總tRNA組分中存在的修飾核苷進(jìn)行了檢測分析，為修飾核苷的鑒定提供了一種新思路。成果于2021年7月發(fā)表在《Journal of Separation Science》。
生物體中的RNA元件，包括核糖體RNA，信使RNA，轉運RNA，剪接體RNA，miRNA等，均需要經(jīng)歷轉錄后修飾成為成熟的分子。這些修飾對實(shí)現RNA元件的功能至關(guān)重要，例如mRNA疫苗必須在RNA鏈上摻入修飾核苷才能在人體中穩定表達。RNA轉錄后修飾主要發(fā)生在核糖核苷（A/U/C/G）的堿基或核糖上，以共價(jià)結合的方式連接一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團。近年研究表明RNA修飾種類(lèi)和修飾率的變化參與到RNA代謝及功能實(shí)現的全過(guò)程，具有重要生理學(xué)意義[1-5]。
更高效的前處理技術(shù)以實(shí)現目標物的富集和基質(zhì)/雜質(zhì)的清除；
更*的分離手段，得到更純、更集中流出的色譜峰以提高目標物的瞬間濃度；
更的檢測技術(shù)以提高目標物信號響應。
目前質(zhì)譜儀因其通用性高、選擇性好和靈敏度高，是主流的檢測技術(shù)，其中，靈敏度是評價(jià)質(zhì)譜等級的重要指標之一。質(zhì)譜儀的靈敏度受多方面影響，其中可以通過(guò)降低進(jìn)入離子源的液流，有效提高離子化效率，從而較大提高質(zhì)譜檢測靈敏度。如目前比較常見(jiàn)的Nano液相、Micro液相和Semi-micro常規分析型液相，我們來(lái)做一下性能對比。
三種液相系統的性能對比
Nano液相的液量有利于LCMSMS離子源的去溶劑化，從而提高質(zhì)譜響應。但是由于液流過(guò)低，其通量較??；另外，納升級的流速對輸液泵的精度和脈沖控制要求非常高，再加上其精密的部件對使用和維護都有很高的要求。故現有技術(shù)下Nano液相的通量和穩定性無(wú)法達到常規分析型液相的水平。而Semi-micro常規型液相已成為相對成熟、應用范圍相對廣的分析手段，這兩項指標非常優(yōu)異，但是，由于較大的液流，導致進(jìn)入離子源，尤其是ESI離子源之后，其去溶劑化效率較差，靈敏度無(wú)法進(jìn)一步提高。 Micro液相的色譜柱內徑介于0.1~1.0 mm之間，流速一般介于1~100 μL之間，流速下的儀器穩定性、耐用性和維護性都比Nano液相有大幅提高，通量接近半微量分析型液相，而其去離子效率相比半微量分析型液相大大提高。因此Micro液相沒(méi)有明顯的短板，理論上是三種液相中相對理想的技術(shù)。
島津微流量液相質(zhì)譜聯(lián)用系統 Mikros-LC+LCMS-8060
在本研究中研究人員報道了尿苷及其衍生物在低溫及高有機溶劑的條件下容易析出造成信號變動(dòng)，指出了利用HILIC等親水原理的核苷酸LCMS分析中需要注意的問(wèn)題。利用島津微流量液相質(zhì)譜聯(lián)用系統測試了總tRNA組分中24個(gè)核苷標樣，確定了各個(gè)標樣所用的母離子和子離子，以及在HILIC色譜柱中的保留時(shí)間。通過(guò)多反應監測及保留時(shí)間，可以區分這些修飾核苷及其同分異構體。
核苷標樣微流量液質(zhì)系統色譜圖
測定了24個(gè)修飾核苷標樣的小檢出量，運用微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢出下限為0.1-1 fmol，而一般用于鑒定修飾核苷所用的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢出下限為1-10 fmol。
運用上述建立的方法，對細長(cháng)聚球藻 PCC 7942中的修飾核苷進(jìn)行定量檢測，僅需含25 ng總tRNA組分的樣品，即可得到清晰的質(zhì)譜結果，而在傳統的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀上得到相同結果，至少需要含100 ng的總tRNA組分的樣品[6, 7]。
細長(cháng)聚球藻樣品圖
海南大學(xué)林桓副研究員：修飾核苷中尿嘧啶核苷及其衍生物電離困難及各修飾核苷同分異構體之間不易區分的特點(diǎn)一直是質(zhì)譜檢測的難點(diǎn)。同時(shí)常規的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢出限較高，需要的樣品量較大，這也是不易提取的樣品檢測的制約條件之一。該研究依托島津公司強大的質(zhì)譜分析平臺，使用微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀分離鑒定總tRNA組分中的修飾核苷，靈敏度較半微流液相色譜——三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀提高了10倍以上。該方法可支持表觀(guān)轉錄組學(xué)的發(fā)展。
【參考文獻】
[1] Lin H, Miyauchi K, Harada T, Okita R, Takeshita E, Komaki H, Fujioka K, Yagasaki H, Goto Y-i, Yanaka K, Nakagawa S, Sakaguchi Y, Suzuki T. CO2-sensitive tRNA modification associated with human mitochondrial disease. Nature Communications. 2018; 9: 1875.
[2] Lian H, Wang Q H, Zhu C B, Ma J, Jin W L. Deciphering the Epitranscriptome in Cancer. Trends in Cancer. 2018: S2405803318300219.
[3] Schimmel, Paul. The emerging complexity of the tRNA world: mammalian tRNAs beyond protein synthesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2017.
[4] Thomas J M, Batista P J, Meier J L. Metabolic Regulation of the Epitranscriptome. Acs Chemical Biology. 2019.
[5] Chionh Y H, Mcbee M, Babu I R, Hia F, Lin W, Zhao W, Cao J, Dziergowska A, Malkiewicz A, Begley T J. tRNA-mediated codon-biased translation in mycobacterial hypoxic persistence. Nature Communications. 2016; 7: 13302.
[6] Kimura S, Dedon P C, Waldor M K. Comparative tRNA sequencing and RNA mass spectrometry for surveying tRNA modifications. Nature Chemical Biology. 2020.
[7] Su D, Chan C T Y, Gu C, Lim K S, Chionh Y H, Mcbee M E, Russell B S, Babu I R, Begley T J, Dedon P C. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 2014; 9: 828-841.
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